蛋白质多肽激素的提取2

L氨水调pH4.5，冷至0～5℃过夜，除去沉淀（沉淀另行回收），清液用4mol/L氨水调pH6.0，加入20%醋酸锌（按每100kg投料加入30ml)，析出白色沉淀。

  结晶  过滤收集沉淀，按下列配方结晶（按100kg投料所得沉淀物计）：2%柠檬酸500ml，20%醋酸锌6.5ml，丙酮160ml，蒸馏水稀释至1000ml，结晶液冷却至0～5℃，用4mol/L氨水碱化至pH8.0，过滤除去沉淀。用10%柠檬酸调节pH6.0，搅拌结晶两天，虹吸除去清液，离心，收集，结晶，用蒸馏水洗2次，丙酮洗2次，五氧化二磷真空干燥得成吕。

离子交换树脂法制备胰岛素

    将牛、猪等之胰腺切细，于pH2.8酸性乙醇中匀浆化，调pH至8.2，使含酶的固体沉淀物除去。将提取液用硫酸调pH为2.8后与阳离子交换树脂接触，使胰岛素被吸附，用低pH水溶液。分离除去蛋白分解酶等污染物。再次用Tris缓冲剂等pH6.5～9的缓冲液使胰岛素溶离后，吸附于阴离子交换树脂上，用pH6.5～9.0缓冲液洗净，除去乙醇，用pH3.2～3.6醋酸使胰岛素。

DEAE-纤维素或Sephadex G-50层析法制备胰岛素

    鸡胰岛素粗品制备  将1kg冷冻胰切成小块，加86%酸性乙醇（含85%磷酸40ml)3l，在高速捣碎，于15℃搅拌抽提2h后，在冷室中过滤，于pH6.0、20℃进行吸附2h，抽滤除去乙醇溶液。将吸附的胰岛素在pH3～3.5洗脱到水溶液中，滤液调pH至2.5，每100ml滤液加氯化钠25g，将胰岛素粗品过滤，用丙酮洗，在空气中干燥，每kg胰脏得粗品约1g。

    粗品纯取  取300～400mg粗品溶于3mol/L醋酸中，离心除去少量不溶物，清液上Sephadex G-50柱（2.5×150cm，中等颗粒），用3mol/L醋酸洗脱并分管收集，每管约5ml。用小白鼠惊厥法测去测出含胰岛素部分并冻干，得并干粉50mg。取冻干粉20mg溶解后，对pH6.0含锌的柠檬酸缓冲液透析的过夜，得胰岛素结晶。

    冻干粉也可用DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化，将30～50mg冻干粉溶于2mlpH7.4的0.04mol/L Tris及0.001mol/L EDTA缓冲液中。将上述缓冲液透析后上柱，用上述缓冲液及含0.15mol/L氯化钠及0.3mol/L氯化钠的上述缓冲液分步洗脱，分管收集洗脱液，每管4ml，将具有胰岛素活力的峰冻干。

蛇胰岛粗品的制备、纯化及结晶方法与鸡胰岛素相似。

　

由鳗心制取降钙素

    取3kg鳗心脏或心包膜作原料，用含用0.6g EDTA的丙酮30l浸泡，5℃5h；脱水的组织用氯仿15l浸泡，5℃2h；上述脱水过程可用15l丙酮重复3次，空气干燥，得到820g干物质（活性为20MRCm U/mg)。

提取  7.5%正丁醇，15%醋酸，5%水提取，50℃24h，提取液加5倍冷丙酮沉淀过夜，沉淀物溶解在0.1mol/L盐酸，经Sephadex G25、Sp-Sephadex G25过滤，滤液用Amicon UM-2滤膜过滤浓缩，再经Sephadex G50、CM-C、Sephadex G50柱层析化，产品经过生物测定活性为4000 MRC U/mg，薄层层析、圆盘电泳、N-末端分析结果为单一物质。

    薄层层折谱Rf值为0.65～0.71，采用纤维素为载体，展开剂为正丁醇：吡啶 ：水：醋酸=15:10:12:3，显色剂为Raydon-Smith试剂：茚三酮；降钙素活性为3700～6000MRC U/mg。

由鳗鱼气管及心包膜提取鳗降钙素

    取鳗鱼食管及心包组织200kg用丙酮400l进行脱脂，得12.6kg丙酮脱脂粉。用10倍量丁醇-醋酸-水（15:3:6,V/V）溶剂于50℃提取2次，提取液真空浓缩至五分之一，加入5倍量丙酮，离心分离出沉淀，沉淀用0.2mol/L盐酸提取2次，然后经Sephadex G-75、Sp-Sephadex G-25、Sephadex G-50及CM-纤维素层析精制，得鳗降钙素（比活力4000MRC U/mg），活力总收率5～6%，精制倍数10000倍。

从猪甲状腺提取猪钙素

    低温将甲状腺绞碎，用冷丙酮反复浸渍，干燥得甲状腺丙酮粉，丙酮粉用0.2mol/L盐酸于60～70℃提取5min，迅速冷却到室温过滤，滤液在5℃左右对0.1mol/L醋酸缓冲液（pH4.6)进行透析，再对透析液进行分段盐析得降钙素粗品。此粗品先经Sephadex G-50、再经Sephadex G-25、最后通过CMC柱吸附，梯度洗脱，得降钙素精品，效价为200MRC U/mg（猪甲状腺丙酮粉为0.045MRC U/mg）。

正常甲状腺含降钙素极微，因此若需制备人的降钙素，可用甲状腺髓质癌患者切除的腺体提取。

猪胸腺激素T1和E1的制备

工艺过程：

  丙酮粉的制备  取新鲜猪胸腺去脂肪及结缔组织，洗去血污，用绞肉机初步绞碎。按1kg胸腺加入2L生理盐水，经高速组织捣碎机破坏，搅拌抽提1h，合并滤液，加热至80℃维持15min，迅速冷却，过滤，所得清液加10倍体积的丙酮沉淀，收集沉淀，得微黄色丙酮粉，冰箱保存备用，1kg胸腺可得丙酮粉7～10g。

  硫酸铵盐析  将相当于1kg胸腺的丙酮粉，按1：6比例加入pH7.0的0.1mol/L PBS，搅拌抽提1h，6000rpm离心15min，收集上清液，沉淀以1：4比例加入上述PBS液再抽提一次，合并2次上清液，加入pH7.0的饱和硫酸铵液使达到25%饱和度，冰箱放置30min后，离心去沉淀，上清液中加入固体硫酸铵使达到50%饱和度，以10%冰醋酸调节pH至4.5，搅拌30min后离心弃去上清液，沉淀混悬于30ml pH8.0的0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液中，离心，得到的上清液对水及pH5.0 0.01mol/L CPB液透析36h以上，调pH至5.0，离心去沉淀，得30ml左右上清液。

   CM-纤维素柱层析  经盐析和透析后的溶液所含成分仍极复杂，经CM-纤维素层析分离后，可获两组初步纯化的有活性的蛋白质。

    CM-纤维素柱层析以pH、0.01mol/L的CPB平衡，一般50ml床体积的柱分离1kg胸腺制备的样品均能获得满意的结果。待分析样品全部进入柱床后，再以平衡用CPB洗涤层析柱，分步收集流出液，以Folin-酚法测定蛋白质含量，合并蛋白质集中部分，是为穿过峰，以F₅T表示。

从猪胸腺提取胸腺素

    提取的猪胸腺素相当于Goldstein等制备的Thymosin F₅，所采用的超滤膜能通过细胞色素C，但肝素溶液基本不能通过，其截留分子量约为20000以下。

    蛋白质测定  取本品2ml加30%磺基水杨酸2ml，溶液澄清。蛋白质反应阳性。

Biuret反应阳性  取本品2ml与10%氢氧化钠溶液2ml混合，再加1%硫酸铜1滴，混匀，溶液呈蓝紫色。

含量测定  采用称重法。一般每毫升含胸腺素F₅3～4mg。

    聚丙烯酰胺凝胶电泳条件  1.6%聚丙烯酰胺凝胶，pH8.9，Tris缓冲液，4%四甲基乙烯二胺催化，电流3mA/管，电压200V，电泳时间45min，考马斯亮蓝G250染色。

    胸腺素F₅凝胶可见一深蓝色的浓集清晰的区带，而胸腺素F₄凝胶管除去与上述相同的一条区带外，还有一条较细的区带及一大片染色区。此结果