蛋白质多肽激素的提取2

从长须鲸（Balaenoptera physalus)胃粘膜提取胃泌素 

胃粘膜

 ↓煮30min过滤

水滤物

 ↓等电点沉淀(醋酸,Ph4.0)

沉淀

 ↓溶于氢氧化铵(ph10.0),加异丙醇及磷酸氢二钾

溶液

 ↓加乙醚

水层

 │DEAE-纤维素吸附,0.1mol/L氢氧化钠洗脱,

 ↓等电点沉淀

沉淀

 ↓冻干

胃泌素

　   胃泌素的生物测定是根据猫或大鼠胃酸排出量计算，以组胺作参考指标，故活性是以组胺单位（HU）/mg表示。

酸醇提取减压浓缩法制备胰岛素

工艺过程：

    提取  冰胰块用刨碎后加2.3～2.6倍量的86～88%乙醇（W/W）和5%草酸，在10～15℃搅拌提取3h，离心，滤渣再用1倍量的68～70%乙醇和0.4%草酸提取2h，同上法分离之。合并乙醇提取液。

   碱化、酸化  提取液在不断搅拌下加入浓氨水调pH8.0～8.4(液温10～15℃），立即进行压滤，除去碱性蛋白，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化至pH3.6～3.8，降温于5℃，静置不少于4h，使酸性蛋白充分沉淀。

   减压浓缩  吸上层清液至减压浓缩锅内，下层用帆布过滤，弃去沉淀物。滤液并入上清液，在30℃以下减压蒸去乙醇，浓缩至浓缩液比重为1.04～1.06（约为原体积的1/9～1/10）为止。

   去脂、盐析  浓缩液转入去脂锅内于5min内加热至50℃，立即用冰盐水降温5℃，静置3～4h，分离出下层清液（脂层可回收胰岛素）。调pH2.3～2.5于20～25℃在搅拌下加入27%（W/V）固体氯化钠，保温静置数h。析出之盐析物为胰岛素粗品。

    精制  除酸性蛋白：盐析物按干重计算，加入7倍量蒸馏水溶解，再加入3倍量的冷丙酮，用4mol/L氨水调pH 4.2～4.3，然后补加丙酮，使溶液中水和丙酮的比例为7：3。充分搅拌后低温放置过夜，使溶液冷至5℃以下，次日在低温下离心分离，或用过滤法将沉淀分离。

   锌沉淀：在滤液中加入4mol/L氨水使pH为6.2～6.4，加入3.6%(V/V）的醋酸锌溶液（此溶液浓度为20%），再用4mol/L氨水调pH6.0，低温放置过夜，次日过滤，分离沉淀。

   结晶 将沉淀过滤，用冷丙酮洗涤，得干品（每kg胰脏得0.1～0.125g干品），再按干品重量每g加冰冷2%柠檬酸50ml，6.5%醋酸锌溶液2ml，丙酮16ml，并用冰水稀释至100ml，使充分溶解，冷却5℃以下，用4mol/L氨水调pH8.0，迅速过滤，滤液立即用10%柠檬酸溶液调pH6.0，补加丙酮，使速溶液体系保持丙酮含量为16%，慢速搅拌3～5h使结晶析出。在显微镜下观察，外形为似正方形或扁斜形六面体结晶，再转入5℃左右低温室外放置3～4天，使结晶完全。结晶离心收集，并小心刷去上层灰黄色无定形沉淀，用蒸馏水或醋酸铵缓冲液洗涤，再用丙酮、乙醚脱水，离心后，在五氧化二磷真空干燥箱中干燥，即得结晶胰岛素，效价每mg应在25U以上。

    回收  pH4.2沉淀物回收 取pH4.2沉淀物用7倍量冰蒸馏水搅匀（包括沉淀中所含的水，按50%），用2mol/L盐酸调pH为2.5，再加3倍（按干品计）冷丙酮，搅拌溶解后用2mol/L氨水调pH为4.2～4.3，然后补加丙酮至30%，冰箱过夜。次日在5℃以下过滤，滤液用2mol/L氨水调pH至6.2，按体积每100ml加入20%醋酸锌1.8ml，再以2mol/L氨水调pH6.0，低温放置过夜，次日过滤，分离沉淀。以下操作按胰岛素精制结晶过程进行。

    pH6.0锌沉淀母液回收（包括pH8.0沉淀物）：用2mol/L氨水将母液调至pH7.0，冰箱放置2～3h(pH7.0时，溶液中的Zn²⁺成为氢氧化锌，可吸附胰岛素共同沉淀出），沉淀物收集后加酸水调pH2.5溶解；pH8.0沉淀物的回收可用4mol/L盐酸溶解并调pH2.5在此合并，过滤，滤液用2mol/L氨水调pH5.25～5.30，放置过夜，过滤沉淀物，按10g湿重折算1g干重进行结晶，按上述精制操作进行。

    无定形沉淀物回收 沉淀物按1/2计算，每g加2%柠檬酸50ml、丙酮16ml、6.5%醋酸锌2ml，加水稀释到100ml使溶解。以下操作同精制。

    pH6.0结晶母液回收 结晶母液用2mol/L盐酸调至25左右，按体积加2倍粗制时盐析后的饱和盐水，放置6～7h后，过滤并抽干。按此盐析物重量加10倍量蒸馏水溶解，再按溶液体积加2～10%的20%醋酸锌溶液，用2mol/L氨水调pH为5.2～5.3，过滤，沉淀称重后再以10倍蒸馏水用2mol/L盐酸调pH2.5溶解，再用2mol/L氯水调等电点pH5.2～5.3，经上述反复3次后，沉淀按湿品十分之一计进行结晶，但碱化工序改为pH6.8，酸化改为pH6.4时析出结晶。也可在得到盐析物后，以下操作用正品，只是按锌沉淀湿品十分之一计算进行结晶。

    油脂回收 油脂1份加水1份，按油脂重的3%加氯化钠，不断搅拌加温到50℃，再静置降温至5℃分出油脂，然后对溶液进行盐析，得盐析物。其它操作与正品精制相同。

    上述各项操作，以pH4.2沉淀物回收得量最多，占整个回收量的近一半，约为正品的10%。其它pH6.0结晶母液回收和油脂盐析物回收也分别达正品的5%左右。

分级提取直接锌盐沉淀法制胰岛素

工艺原理

    根据胰岛素易与锌离子结合的性质，用氯化锌作沉淀剂，使胰岛素直接从初步除去碱性和酸性杂蛋白的提取液中沉淀析出。由于草酸根可与锌离子络合，干扰胰岛的沉淀，故提取时不采用草酸用改用硫酸和盐酸。为减少含锌量，进行两次氯化钠盐析。精品按一般精制方法处理。

工艺过程：

  提取  将冻胰用刨胰机刨碎，每100kg胰脏加300l82%乙醇，于10～12℃加入12mol/L硫酸，调pH2.8～3.0，搅拌提取0.5h。加入6mol/L盐酸调pH至2.0，继续搅拌提取2.5h，分离残渣，残渣加入65%乙醇150l，用6mol/L盐酸调pH2.0，10～12℃搅拌提取2h，分离残渣。合并2次提取液。

  碱化  提取液冷至0～5℃，用浓氨水调pH7.8～8.0，加入硅藻土（每100kg胰脏加6kg)，板框压滤，随即用混合酸（盐酸4000ml、硫酸1000ml、水4000ml)酸化至pH2.5，待沉淀完全后虹吸清液，吊滤，除去沉淀，温度控制在0～3℃。

  第一次锌沉淀  清液加入氯化锌溶液（每100kg胰脏加3kg氯化锌，先配成30～50%溶液，用6mol/L盐酸调pH2.5后加入），温度2～4℃，待沉淀完全后，虹吸清液，吊滤，除去沉淀，清液用浓氨水调pH至6.8～7.0，于5℃过夜。

  脱脂、盐析  次日虹吸除去清液，沉淀过滤、收集，溶于5倍量蒸馏水，用6mol/L盐酸调pH2.7～2.8，12～15℃放置。次日放出下层清液（上层脂肪再用5倍量蒸馏水洗涤，回收下层清液，供下批锌沉淀溶解用），清液用6mol/L盐酸调pH至2.5，再加入16%氯化钠盐析，过滤，收集第二次盐析物。

30%丙酮分级沉淀  第2次锌沉淀盐析物溶于7倍量水中，加入3倍量丙酮，用4mol/