酶的提取与制备2
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增大字体洗脱 除去上清液，加入磷酸氢二铵，用8.6%氨水调pH至8.4，搅拌洗脱2h，按含水量加1%氯化钠，搅拌10min，加入92%以上浓度的乙醇，使含醇量达45%，静置过夜。纸浆过滤，收集滤液。
沉淀干燥 滤液用2mol/L醋酸调pH至6.7，搅拌加入92%以上的乙醇至含醇量为80%，静置，除去上清液，离心。沉淀用丙酮洗涤脱水，真空干燥。
精制 粗品用25倍量醋酸铵溶液溶解，调pH为6.5～6.7，加等量95%乙醇，冷藏静置过夜，离心沉淀，用丙酮脱水，真空干燥，即得。
颌下腺K的提取与纯化
提取 新鲜的颌下腺贮于-20℃，冷冻组织绞碎后加0.1mol/L醋酸溶液在5℃高速匀浆1min(5L/kg组织)，匀浆物在20℃、19000×g离心，分出上清液并用氢氧化钠液调pH7.0。
丙酮分级沉淀 边搅拌边向上述清液中加入预冷至5℃的丙酮，使浓度为35%（v/v），5℃放置过夜，离心除去沉淀，再向上清液中补加丙酮，使其浓度为65%，5℃下连续搅拌2h，同样方法离心，收集沉淀，将沉淀溶于一定量用氨水调pH7.5的水中。
纯化 颌下腺K依次经DEAE-23纤维素吸附层析、偶联了Aprotinin的Sepharose-4B亲合柱层析和DEAE-SephadexA-50柱除核酸纯化，得到的产品经超速离心分析为均一蛋白，在SDS-凝胶上电泳出现两条带，主要成分为KB，另有微量的KA。
注：提取胰α-K时除加0.1mol/L醋酸外，还需加大豆胰蛋白酶抑制剂和EDTA作保护剂。提取物经硫酸铵分级沉淀和反复地吸附层析、凝胶过滤，得到园盘电泳呈单一条带的胰α-K。胰脏匀浆物在一定条件下自溶使酶原活化后，可得到两条多肽链的胰β-K，再经DEAE-纤维素柱层析等一系列其它步骤，可分离到胰β-K的A、B两种形式。
Kira等曾以猪胰脏丙酮粉为原料，用经浓醋酸调pH4.1蒸馏水提取、除蛋白、过两次偶联了牛肺胰蛋白酶抑制剂（BLTI）和大豆胰蛋白酶抑制剂（SBTI）的Sepharose-4B亲合柱，然后经两次DAEA-Sep-hadex A-50柱层析，得到3种组分，依其从DEAE-Sephadex A-50柱上洗脱的顺序分别命名为KⅠ、KⅡ，KⅡ，即KⅠ首先洗脱下来，KⅡ与前人报道的KA、KB相近。
猪胰K的提取与纯化
工艺路线：
绞碎、匀浆、室温下自溶18h、加水调节ph→6 55℃加热5mim 冷丙酮至33%、过滤
新鲜去脂速冻猪胰─────────────→上清液──────────→滤液
过滤 硫酸铵介吸 丙酮至 丙酮、乙醚减压真空
───────→DEAE───────→洗脱液───────→沉淀───────→粗制K丙酮粉
加蒸馏水离心 DEAE层析柱层析 浓缩、脱盐、真空干燥
───────→上清液───────→收集活力部分───────→猪胰K冻干品
固定化大豆胰蛋白酶抑制剂的制备及对猪胰K的处理：
Sepharose-4B 2g，加蒸馏水150ml，溶涨后置于三孔圆底烧瓶内。取溴化氰2g加蒸馏水80ml溶解，在25℃下加入上述烧瓶内，调节pH至11，搅拌反应6min，过滤，凝胶用0.1mol/L碳酸氢钠冲洗，再用0.05mol/L Tris-盐酸缓冲液（pH8.0）平衡。
称取大豆胰蛋白酶抑制剂320mg用少量平衡液溶解，加入到上述活化的Sepharose4B中，再用上述平衡液稀释到Sepharose4B/溶液（v/v)=40%，搅拌2h，然后在4℃反应16h，装柱，用平衡液冲洗，再用1mol/L乙醇胺处理以封闭剩余的活化凝胶，然后用0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.0,内含1mol氯化钠）和0.1mol/L醋酸缓冲液（pH4.0，内含1mol氯化钠）反复冲洗，再用蒸馏水冲洗，备用。
猪胰K纯化后的冻干品配制成10mg/ml溶液，缓慢经过处理好的固定化大豆抑制剂柱，醋酸铵缓冲液（pH7.0)洗脱，收集洗脱液，对水透析去盐，真空干燥，得去除蛋白水解酶的猪胰K。
猪胰K的制备
粗品制备 猪K丙酮粉，加20倍量0.02mol/L醋酸，于10搅拌提取12h，离心。渣加10倍量0.02mol/L醋酸提取6h，合并滤液，加冷丙酮至浓度达33%，过滤，滤液补加冷丙酮至70%，静置4h，离心，收集沉淀，用丙酮、乙醚脱脂，脱水，真空干燥。
中间品制备 粗品K加50倍量0.2冷氯化钠液，用氨水调pH8.0搅拌溶解后经纸浆过滤。滤清液冷至2～3℃，加冷丙酮使浓度达40%，冷室装置过夜，离心。清液补加冷丙酮至浓度为60%，静置4h，离心，沉淀用丙酮、乙醚洗涤，真空干燥，得K中间品。
精品制备 将中间品溶于0.001mol/LpH4.5醋酸缓冲液中，离心，清液加入弱酸性阳树脂Amberlite CG-50(钠型）树脂（树脂：中间品为5:1）搅拌吸附2h，收集树脂用0.001mol/LpH4.5醋酸缓冲液漂洗树脂至无泡沫。树脂用2倍量1mol/LpH5.0氯化钠液搅拌洗脱1h，分离树脂，洗脱液透析脱盐，冻干，得精品K，纯度100U/mg以上。
浙江蝮蛇蛇毒激肽释放酶Ⅰ的分离纯化
DEAE纤维素（ED-22）柱层析 称取20g蛇毒丙酮干粉先经70%甲醇抽提粗毒中的激肽增强肽，沉淀部分制成丙酮干粉，溶于约60ml含10-2molEDTA的0.01mol/L磷酸氢二钠溶液中，不溶物离心除去，调至pH8.0，加水稀释至500ml左右，上DE-22柱（5×50cm，预先用0.01mol/lpH7.8磷酸缓冲液平衡），梯度洗脱，第1级取0～0.1mol氯化钠（各6000ml，配于0.01mol/LpH7.8磷酸缓冲液），第2、3、4级分别取0.1～0.2mol氯化钠；0.2～0.4mol氯化钠，0.4～1.0mol氯化钠，均配于同一缓冲液，各取3000ml，流速200ml/h，每瓶收集100ml，在5℃下收集。第2个酯酶峰经生物活力测定，具有激肽释放酶活力，合并第25～45瓶。第3个酯酶峰为类凝血酶部分。
DEAE纤维素（DE-52）柱层析 经DE-22柱层析分离之激肽释放酶部分稀释酶部分稀释到电导为0.15×104后（约6000ml)，于冷室中上DE-52柱（4×23cm)，0.01mol/LpH7.8磷酸缓冲液平衡），上柱流速100ml/h，约75%的杂蛋白不被吸附而流出。然后用0～0.05mol氯化钠（各1000ml，配于同一缓冲液）梯度洗脱出一个含有激肽释放酶活力的蛋白峰。
DEAE纤维素（DE-22）重层析 DE-52层析收集液经透析、冷冻干燥后共得200mg粗制品，称取70mg溶于0.01mol/LpH7.8磷酸缓冲液，在DE-22柱（2.3×19cm，同一缓冲液平衡）上重层析。梯度洗脱，第1级用0～0.05mol氯化钠（各500ml)，第2级用0.05～0.1mol氯化钠（各250ml)，
