酶的提取与制备2

    细胞色素C在一定条件下可以吸收、转运和进入靶细胞膜。氧化型细胞色素C对线粒体亲合力及心肌固着力均比还原型细胞色素C为好。两者氧化还原的情况也不相一致，在生物学效应方面还原型细胞色素C远不及氧化型细胞色素C。细丙具有催化O2-·的作用形成O2-·/O2循环，这很有实际意义，可考虑扩大临床应用于抗炎、抗衰老等方面。

磷酸脂酶（Phospholipase A₂, Phospholipase A₁, Lysophoslipase, Phospholipaes C, PhospholipaseD)

    磷酸脂酶是磷脂质的水解酶，水解甘油磷脂质及神经鞘磷脂质。由于被水解的甘油磷脂质的酯链位置不同而命名为A₁，A₂，C，D。水解溶血磷脂质的脂肪酸酯的酶被称为溶血磷脂酶。水解磷脂质C-1位及C-2位双方酯链生成2分子脂肪酸及1分子甘油磷酸衍生物的酶，传统称为磷酸脂酶B，它与溶血磷脂酶同样对待。

    在磷脂酶A（A₁及A₂）方面，对蛇毒及哺乳类胰磷脂酶A₂的研究较深入。它们的一级结构已被确定。胰酶是胰液的消化酶，一般以前体形式存在，由胰蛋白酶水解成活性型。磷脂酶A为细胞内酶，存在于哺乳动物几乎所有的脏器及细胞中。一般认为它参与膜磷脂质的代谢。

    溶血磷脂酶广布于细菌及动物细胞中。同一酶不仅作用于溶血磷脂质，对磷脂质多数也显示活性。对来源于牛胰的肝酶研究较多。磷脂酶C也广布于动物细胞中，多数特异地作用于磷脂酰肌醇，分类属于—磷脂酰肌醇磷酸二酯酶（EC3.1.4.10)。

    磷质酶D除广布于胡萝卜、洋白菜等植物组织及微生物外，动物细胞（大鼠脑、人嗜酸球）也含有。除水解磷脂外，尚有向伯醇磷脂酰基转移活性。

活性及应用

    胰酶在肠液中消化脂肪、蛋白质和淀粉，使这些营养成分被细胞吸收和利用。助消化药。主用于消化不良、食欲不振及肝、胰腺疾病引起的消化障碍。也适用于先天性胰功能不全（儿童和青少年胰脏发生囊性纤维病变引起胰功能不全）、腹部手术和外伤胰腺切除导致的胰功能不全、未经手术切除后天引起的胰功能不全及酒精中毒的慢性胰腺炎等。

    胰酶制剂不能提高原发性胰分泌不足，而只是对酶分泌量不足的补充。口服胰酶制剂应防止胃酸对酶的破坏。应服其肠溶衣制剂。近年来开发的胰酶微囊制剂，临床应用似有一定前途。

    此外，它也可作为治疗糖尿病的辅助药物。6个月后婴儿抗体减退、脂肪代谢紊乱、皮肤干燥、视力减退及支气管炎等病人也可用胰酶。它也是老年保健药物之一。因它具有降血脂促进维生素A、E、B₁₂吸收等作用。

蛋白质多肽激素

    激素是一类动物体内的化学信息分子。动物激素是指由动物腺体细胞和非腺体组织细胞所分泌的一切激素。蛋白质多肽激素包括由丘脑、脑垂体、胰腺、甲状旁腺、甲状腺、胸腺、胃肠道、肾、胎盘、睾丸、卵巢及其他非腺体组织所分泌的多种激素。

尿激酶

    自Mactarlane (1947) 发现尿中有溶解凝血作用的物质之后，1952年Sobel对该物质进行了研究，并命名为尿激酶。UK是由肾细胞产生的一种纤维蛋白溶酶原激活剂。属一种碱性蛋白质的丝氨酸酯酶。有多种分子量形式，主要有31300及54700。存在于人及哺乳动物尿中。鲜尿中几乎是大分子量尿激酶（HUK），小分子量尿激酶（L-UK）是其降解产物。人尿中UK平均含量5～6IU/ml。也可由肾细胞培养法制取L-UK。临床实践表明，H-UK治疗血栓症的效果比L-UK好。动力学研究也证明，H-UK激活其天然底物溶纤酶原（PG）的米氏常数（Km）仅为L-UK的一半。

    通过Sephadex G-100、Sephadex G-75、SP-Sephadex C-50系列柱层析，纯化的人尿尿激酶分为两种活性形式。它们在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、凝胶梯度电泳及Ouchterlony's双向免疫扩散法皆呈均一组成（pI为8.7、8.9、9.1、9.2、9.4)，L-UK也有同样数目的亚形式（pI7.5、8.3、8.8、9.4、9.7)。具有最高比活的H-UK亚形式PI为9.4，L-UK亚形式为pI8.3及8.8。有人认为精制后的UK亚形式不符合体内的形式，是精制过程中的赝象。

树脂吸附法制取UK

    碱化除沉淀  将男性尿用5mol/L氢氧化钠调pH至碱性，静置1h，虹吸上清液，弃去白色沉淀。

树脂吸附UK  将虹吸的上清液用5mol/L盐酸调pH，加树脂，搅拌1.5h，树脂自然下沉，收集吸附有UK的树脂。

    洗涤  用0.1mol/L pH5.5的磷酸缓冲液（上清液体积的10%）搅拌洗涤30min，虹吸除去上清液，再以0.1mol/L pH6.4的磷酸盐缓冲液搅拌洗涤30min，收集树脂。

  洗脱  第1次洗脱用氨水搅拌洗脱1.5h，第2次洗脱以同样量的洗脱液搅拌洗脱0.5h，抽滤，收集洗脱液，合并洗脱液，测量其体积。

    硫酸铵沉淀  按洗脱液体积加入固体硫酸铵，不断搅拌使其溶解，并使其饱和度达65%，用5mol/L盐酸调pH为8.6，于0～2℃沉淀8h，离心收集，得棕色UK沉淀。

H-UK与L-UK的分离与纯化

    将部分纯化的UK300mg(比活1000IU/mg蛋白）溶于10l pH9.0氨水中，加入固体氯化钠调节电导至23mv/cm。将此溶液通过一预先用0.01mol/L磷酸缓冲液-0.2mol/L氯化钠液（pH8.0)平衡的Amberlite-IR938型阴离子交换树脂柱（4×8cm)，流速2l/h。于4℃下收集流出液（无色，比活为17000IU/mg蛋白，活力回收90%)。将流出液用1mol/L醋酸调节pH至4.2，并加蒸馏水调整电导至15.6mv/cm，进行CMC柱层析（2.0×4.0cm）。柱预先用0.1mol/L pH4.2醋酸缓冲液平衡，以20ml/min流速上样，然后用0.1%氨水-0.1mol/L氯化钠溶液洗脱。洗脱液比活为8000IU/mg蛋白，活力回收80%以上。

    将比活为8000IU/mg蛋白的UK溶液对0.03mol/L pH6.8磷酸缓冲液透析后参照White法进一步用羟基磷灰石吸附柱层析分离两种UK。羟基磷灰石柱（1.9×2.85cm)用相同缓冲液平衡。样品上柱后用0.1mol/L和0.2mol/L pH6.8磷酸缓冲液分步洗脱，将H-UK和L-UK完全分开。

猪颌下腺K的制备

工艺路线：

        水、酸、二甲苯   氢氧化铝          磷酸氢二铵、氨水、氯化钠    乙醇、丙酮            水、醋酸铵                      活性炭

猪颌下腺────→滤液────→吸附浆────→洗脱液────→粗品────→溶液────→溶

          pH4.5                           pH8.4         

    乙醇，丙酮

液────→精品

工艺过程：

    提取  取新鲜或冷冻的猪颌下腺，去尽脂肪，绞碎，每100kg加5倍量水搅拌提取，用醋酸调pH，并加入二甲苯防腐。提取12h，补加二甲苯600ml防腐。保持pH至酸性，提取12h，滤取滤液。

    吸附  滤液加氢