蛋白质提取与制备

蛋白质纯度

    蛋白质提纯以后需要有指标来说明它的纯度，从原则上看有许多制备纯化蛋白质的方法是可以将它们改成分析方法的，如各种分析的电泳、微量凝胶过滤法、各种层析、结晶出现、生物活力及免疫分析等。用一种方法一个条件来分析蛋白质的纯度是不够的。由于蛋白质数量多，性质相似者在所难免，一个条件下两个蛋白质不能分开的可能性是很大的，一般均希望用两种以上的方法来分析蛋白质的纯度。只有一种检定方法时应该用两种以上条件来鉴定。对蛋白质纯度的要求因工作需要而异，生物制品考虑制品体内的副作用，物理化学研究要求不干扰对象的物化性质，化学结构分析要示杂质含量低于分析方法的灵敏度等等均要作具体分析。

    确定蛋白质（或多肽）样品的纯度标准大致如下。即分子大小是否均一，电荷 是否均一，是否具有恒定的氨基酸组成，是否具有单一的N末端和C末端残基，进一步纯化时生物活性是否再有提高及能否结晶等，从N末端测顺序一般在4步以上。如果都是单一的氨基酸残基，则含杂质可能为十六万分之一。

    上述几条是较严格的要求，很难全都达到。通常以电泳时呈现一条带以及末端残基鉴定是单一的即可进行顺序测定。

    随着分析技术水平的不断提高，经常还将一种曾认为是纯的蛋白质分离成几个组分，即出现微不均一性（Microheterogeneity）的现象。这种不均一性可分为两类情况。一类是在蛋白质肽链合成后在加工中产生的，如糖蛋白由于含糖量不同，它们的电泳行为常表现很大差异，又如赖氨酸的甲基化，丝氨酸的磷酰化以及磺酰化等，也会产生电泳行为的不均一性；还有一些则是在分离纯化过程中人为产生的，如脱酰氨等，这种不均一性对蛋白质顺序分析不会带来太大的困难。另一类不均一性是由于基因家族产生的，它们之间的不同表现为个别氨基酸的替换、N端或C端肽段的缺失等，这种不均一性会给蛋白质分析带来很大困难。但蛋白质分子的一部分分子的一个侧链酰基变成了羧基，糖蛋白的配基相差一个单糖，这种情况下蛋白质化学结构仍是单元一蛋白质，生物功能也无任何影响。此外还有同功蛋白质（Isoprotein），它的功能相同但化学结构不同，从功能上看纯了从结构上看不纯。因此，纯度属相对的概念，具体情况要多做具体分析，切不可简单化。

大鼠肝细胞核的制备

    新鲜大鼠且生理充分洗净后，用滤纸吸干血水，按每克（鲜重）加入9ml冷的0.25mol蔗糖液（内含微量的Ca²⁺防止细胞核集聚及减少细胞核的脆性），在0～4℃下匀浆数分钟（以下操作在0～4℃下进行）。取匀浆液10ml移到离心管中，沿壁小心加入10ml0.34mol/L蔗糖液，覆盖于上层，在700×g下离心10min，离心时加速及减速均要缓慢地上升或下降，避免2层混合。上层用毛细管移去（留作粒线体制备之用）。所得沉淀即为粗细胞核部分。为了进一步纯化细胞核可将沉淀再悬浮于0.34mol/L蔗糖液中，再次匀浆数分钟，匀浆液在1000×g或更高速度下离心，除去一清液，沉淀再悬浮于0.25mol/L蔗糖液中以700×g离心，沉淀即为纯化的细胞核部分。